Non solo sperimentazione animale: l’uso del FBS per le colture cellulari

Non è molto noto, ma in ricerca vi possono essere degli impieghi indiretti degli animali: è ciò che avviene con il siero fetale bovino (FBS), un prodotto secondario dell’industria della carne, impiegato per le colture cellulari. Come evidenziano esponenti del mondo della ricerca, il FBS presenta dei limiti scientifici ed etici: nell’ottica di ridurne l’impiego – e quindi andare anche verso una ricerca che coinvolga sempre meno gli animali – molti ricercatori richiamano all’importanza di mettere a punto e sperimentare prodotti alternativi, cercando di superare i limiti di quelli a oggi disponibili

Se si pensa al coinvolgimento degli animali nella ricerca scientifica, inevitabilmente, il pensiero corre ai modelli usati per le sperimentazioni, i test di efficacia e sicurezza dei farmaci, la ricerca di base e così via. In realtà, sebbene in modo indiretto, questo coinvolgimento può avvenire anche in altri contesti: è il caso di molte linee cellulari, coltivate in laboratorio per i più diversi scopi, dallo studio di una malattia a quello dei meccanismi cellulari.

Queste cellule, infatti, crescono in appositi terreni di coltura che forniscono loro tutte le sostanze necessarie. Tra gli “ingredienti” dei terreni, uno dei più largamente impiegati, soprattutto per la coltura di cellule eucariote, è il siero fetale bovino (FBS, fetal bovine serum): si tratta del plasma raccolto dai feti di mucche gravide subito dopo la macellazione, e che quindi rappresenta un prodotto secondario dell’industria della carne.

Il siero fetale bovino fornisce alle cellule molti elementi, tra cui ormoni e fattori di crescita, che ne consentono la proliferazione nelle piastre di coltura. La sua efficacia ha contribuito a renderlo uno dei supplementi di gran lunga più popolari nei laboratori di ricerca; tuttavia, il suo impiego presenta dei limiti scientifici che, uniti ad alcune considerazioni di ordine etico, portano molti scienziati a cercare soluzioni alternative. Cerchiamo qui di capire quali sono e quali limiti presentano a oggi.

Composizione ignota, risultato variabile

Il siero fetale bovino è da una parte un supplemento che si è dimostrato molto valido per la coltura di diverse linee cellulari, in particolare quelle eucariote (come quelle animali, quindi), ricco di fattori di crescita e di adesione, di ormoni e altre sostanze che ne consentono la proliferazione e povero invece di anticorpi che potrebbero danneggiarle. È noto fin dagli anni ’60 che il suo impiego consente il mantenimento delle linee cellulari per tempi piuttosto lunghi e, inoltre, è relativamente economico. Tutti questi elementi lo hanno reso un supplemento molto popolare per i terreni di coltura.

Ma, come per la stragrande maggioranza dei prodotti di origine animale, la sua composizione esatta non è del tutto nota e ogni partita di siero può presentare delle differenze rispetto ad altre provenienti da diverse regioni o prelevate in momenti diversi dell’anno. Ciò determina una certa variabilità del siero in grado d’influenzare direttamente il risultato sperimentale: le cellule coltivate con un certo lotto di FBS possono presentare differenze morfologiche, o crescere in modo diverso, o ancora rispondere in modo differente nel setting sperimentale da un laboratorio all’altro. In altre parole, l’uso del FBS può compromettere la riproducibilità di un esperimento. Come scrive Jan van der Valk, ricercatore dell’Università di Utrecht e coordinatore del 3Rs Centre, in una recente perspective apparsa su Science, all’interno di un singolo laboratorio questo si può risolvere con complesse procedure di batch testing ogni volta che si deve usare un nuovo lotto di FBS, ma rimane comunque aperta la questione della variabilità tra un laboratorio e l’altro.

Questo, continua van der Valk, può risultare particolarmente problematico nel campo della ricerca applicata, per esempio nei test di sicurezza per determinate sostanze o farmaci: immaginiamo, per esempio, una coltura cellulare che cresce meno bene di un’altra può rispondere diversamente quando esposta ad una stessa sostanza.

Ancora, la provenienza del siero fetale bovino fa sì che si possano presentare dei problemi di contaminazione dovuti alla presenza di tossine o patogeni. Questo è stato particolarmente evidente all’inizio degli anni ’90, a seguito dei casi di encefalopatia spongiforme bovina (la cosiddetta “mucca pazza”), una patologia dovuta alla presenza di un prione, cioè una proteina alterata, che causa gravissimi danni all’apparato nervoso. All’epoca, il rischio di risposte immunitarie non volute, oltre a quello dell’irriproducibilità degli esperimenti, aveva portato le agenzie regolatorie statunitense (FDA) ed europea (EMA) a scoraggiare l’uso di FBS per le colture di tessuti e cellule nell’ambito della ricerca applicata.

A ciò, vale la pena aggiungere quanto riportato dal report Fetal Bovine Serum (FBS): Past-Present-Future pubblicato dall’Unione europea a seguito del terzo workshop sul tema, nel 2018: la mancanza d’informazioni precise su produzione, domanda e volumi di siero fetale bovino a livello globale rendono possibili frodi e abusi. È quanto avvenuto nel 2013, quando un’indagine dell’FDA ha rivelato che oltre 140 lotti di FBS erano stati adulterati con sostanze come additivi per la crescita e albumina.

Le alternative tra limiti e prospettive

È per tutte queste ragioni che molti scienziati chiedono e indagano la possibilità di usare altri tipi di additivi per i terreni di coltura cellulare. Diversi sono quelli disponibili, di origine animale o vegetale o anche completamente di sintesi; per quanto riguarda le ricerche su applicazioni cliniche, in particolare, si preferiscono di norma terreni di coltura privi di sostanze derivate da altre specie animali e contenenti invece, per esempio, siero umano o lisati di piastrine umane (human platelet lysates) che, secondo alcuni articoli (tra cui una recente review pubblicata sul Journal of Translational Medicine) si dimostrano valide alternative all’uso del FBS. Come avverte van der Valk, però, anche questi prodotti sono soggetti a una certa variabilità di composizione e possono dunque riportare agli stessi problemi di riproducibilità degli esperimenti.

Per questa ragione, soprattutto laddove la riproducibilità risulta particolarmente importante, sempre maggior attenzione è rivolta agli additivi sintetici, di composizione ben definita e specifici per ogni tipo cellulare. Tuttavia, nemmeno le sostanze di sintesi sono completamente prive di limiti. Tra questi, van der Valk segnala per esempio una formulazione per cui non è sempre data la possibilità di conoscere le quantità esatte dei diversi componenti, e quindi i loro potenziali effetti sulle cellule, per ragioni commerciali e di proprietà del produttore. Ancora, bisogna considerare che il costo può essere relativamente elevato e che, essendo specifici per i diversi tipi cellulari, possono creare problemi in modelli in vitro che prevedono l’impiego contemporaneo di diversi tipi cellulari in un singolo sistema.

Insomma, come conclude anche il report europeo, non è possibile cessare l’impiego di FBS senza avere alternative altrettanto valide – pur considerandone i problemi scientifici, cui si aggiungono alcune considerazioni etiche. Sebbene, infatti, il prelievo del FBS avvenga dopo la macellazione della mucca, in un contesto, quello dell’industria della carne, nel quale la morte del feto si verificherebbe in ogni caso, il suo prelievo (che avviene tramite una siringa inserita nel cuore) causa probabilmente dolore e stress. Il documento europeo si chiude con una serie di raccomandazioni che vanno proprio nella direzione di aumentare gli sforzi alla ricerca di tali alternative e limitare, dove possibile, l’uso del siero fetale bovino. Per esempio, tra le indicazioni elencate nel report vi è l’implementazione di database degli additivi serum-free (alcuni già disponibili, per esempio qui), il supporto da parte dell’UE alla produzione e alla commercializzazione di modelli che non richiedano l’uso del FBS, l’evitare di fare riferimento a protocolli che ne prevedono l’impiego se vi è un’alternativa altrettanto efficace.

«Il principio che guida la ricerca è quello delle 3R (replacement, reduction, refinement), che ha lo scopo complessivo di ridurre quanto più possibile il coinvolgimento degli animali. Se l’attenzione, pubblica ma anche da parte degli stessi ricercatori, si accende soprattutto sulla sperimentazione – ossia, in generale, sulle pratiche e gli esperimenti che coinvolgono in modo diretto gli animali – la discussione sul siero fetale bovino evidenzia come in realtà l’interesse per la tutela degli animali abbia uno spettro anche più ampio», commenta Giuliano Grignaschi, portavoce di Research4Life. «Questa discussione è, d’altronde, un esempio della complessità della ricerca scientifica: non possiamo dare nulla per scontato ma dobbiamo spesso valutare e sperimentare diverse alternative – che di frequente possono dover essere usate insieme per completarsi l’un l’altra – per trovare la strategia più efficace al nostro scopo».